技术开源:实验室级单分子显微镜“平民化”

近年来,单分子检测技术作为一种能够实现生物单分子在时间以及空间尺度上的精准研究的技术,得到人们的广泛关注。其中,单分子光学显微镜的问世,使我们可以观察、检测甚至操纵单个分子,并且研究它们的构象变化和动力学行为,使得在大量采样平均化的传统研究体中所隐藏的信息得到新的重视。基于单分子光学显微镜的单分子检测技术的发展,已经揭开了生命科学研究的新篇章。

其中,基于荧光共振能量转移(Förster Resonance Energy Transfer,FRET)技术的单分子光学显微镜可实现纳米量级的单个分子间距离的测量。

FRET是一种将激发能从供体荧光团转移到距离很近的受体发色团分子上的能量转移现象。能量转移的效率与两个荧光包之间距离的六次方成反比,因此通过测量FRET效率,形成精确的“光谱尺”,其精度支持低于10纳米的空间信息,因此广泛用于测量如核酸以及蛋白质等生物分子。

单分子荧光显微镜的发展以及新的荧光探针的问世使得FRET为研究活细胞中的分子间交互提供了强有力的技术支持,包括活细胞中的蛋白质追踪和生物化学反应。为医学诊断的精准度和单分子量级的生化研究新突破奠定了基础。

然而,现有的单分子光学显微镜结构复杂、操作繁琐,并且要求专业的基础设施,包括暗室和光学平台,以及复杂的实验设计。并且,通常一台单分子FRET显微镜的价格超过50万美元。

近日,来自英国谢菲尔德大学的研究人员设计并打造了成本约为50,000美元(市场价格的1/10),基于FRET技术的单分子显显微镜“smfBox”,该研究成果发表在Nature Communications

研究人员不仅共享了smfBox详细的构建说明和开源软件,将成本缩减到了市场价格的1/10。同时,研究人员提出了一种简洁的操作理念,使得生化领域实验室的工作人员经过简单的培训就可以实现对smfBox的操作和使用;并且smfBox中激光器可以被密封起来,使得基于FRET单分子显微镜在正常光强下也可以实现稳定操作。获取更多前沿科技 信息 请持续关注:https://byteclicks.com

smfBox通过一个共聚焦点检测自由扩散的单个分子的供体和受体在不同泵浦光的状态。在绿色泵浦光下的激光通常决定了FRET的效率,与此同时,对红色泵浦光则确认分子中活跃受体的存在,并进行相应计算。

smfBox交替激发光源的周期可以根据需要自行调节,可以实现快循环,慢循环,周期性以及非周期性的循环方案。并且,研究人员在激发路径上放置了一个10:90的光分束器,将激发光束直接连接到光电探测器,以便在实验过程中对激光强度进行实时监测。

图1 本研究提出的基于荧光共振能量转移技术(FRET)的单分子光学显微镜
图1 本研究提出的基于荧光共振能量转移技术(FRET)的单分子光学显微镜

smfBox由三个主要的模块组成:分别是“激发路径”、“样品载台”和“出射路径”。激发路径中,由激光器出射的泵浦光经过校准(L1)和裁剪(Iris),由两个反射镜(M1、M2)引入到一个10:90的分束器(BS1)上。10%的光束聚焦在光电二极管上,用于功率测量和周期监控;90%的光束通过分色镜1 (DC1)导向物镜,不满足DC透射条件的背反射光被DC1和BS1反射到CCD camera上,以便精确聚焦。样品载台部分,来自样品的荧光发射穿过DC1并聚焦在针孔(P1)上,以去除离焦光。最终,被分色镜2 (DC2)分离到两个雪崩光电二极管(APD0,APD1)之一上。

图2 smfBox内部构造示意图

图2 smfBox内部构造示意图

为验证smfBox在实际工作中的性能,研究人员针对DNA发夹(一种可以根据盐溶液的浓度在两种不同的结构状态之间切换的生物分子)在不同NaCl溶液浓度中的开关转换效率进行smfBox的性能测验。实验结果与商用单分子显微镜得到的实验参数有着良好的匹配度。

许多医学诊断正在朝着提高灵敏度的方向发展,而实现超高灵敏度监测的终极目标之一便是准确的高精度的单分子监测。

谢菲尔德大的研究团队设计并建造了一个专业显微镜,并共享了构建说明,以帮助将该设备提供给世界各地的许多实验室,并希望推动单分子检测技术的平民化。这将使研究人员能够更好地了解生物分子水平上的分子相互作用和运动,推动药物开发的进展并帮助应对应对艾滋病病毒和COVID-19等全球性挑战。[撰稿 | Alex(新加坡南洋理工大学 博士生)]

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